本實(shí)驗(yàn)按照《GB 5413.20-2022 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測(cè)定》中第三法液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法,對(duì)膽堿標(biāo)準(zhǔn)品及實(shí)際樣品進(jìn)行了測(cè)定。
標(biāo)準(zhǔn)品分析結(jié)果
按照《GB 5413.20-2022 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測(cè)定》中LC-MS方法,對(duì)膽堿標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了分析。
國(guó)標(biāo)方法中使用Amide色譜柱,本實(shí)驗(yàn)使用等效HILIC型PC色譜柱(磷酸膽堿鍵合型HILIC色譜柱)進(jìn)行了分析,由于CAPCELL CORE PC色譜柱保留能力更強(qiáng),考慮整體分析時(shí)間,以及蛋白樣品可能在初始比例有機(jī)相中析出等問題,我們將初始有機(jī)相百分比降低至80%進(jìn)行了分析。
如圖1所示,膽堿標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間為3.0 min,峰型良好。
同時(shí)我們按照國(guó)標(biāo)方法中的要求,對(duì)膽堿系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品(0.010 -0.200 mg/L)進(jìn)行分析,得到良好線性結(jié)果,r=0.9979,如圖2所示。
方法檢出限為0.18 mg/100g,滿足方法檢出限要求。
圖1 標(biāo)準(zhǔn)品分析結(jié)果
【色譜條件】
色譜柱:CC PC S2.7; 2.1 ×100mm
流動(dòng)相:A:10 mmol/L甲酸銨,甲酸調(diào)節(jié)pH為5.0
流動(dòng)相:B:乙腈
流動(dòng)相:B% 80%(0min) - 80%(1min) - 60%(3min) - 60%(5min) - 80%(5.1min) - 80%(8min)
流動(dòng)速:0.3 mL/min
溫動(dòng)度:40 ℃
檢動(dòng)測(cè):LC-MS; ESI; 104.1>60.0(CE 22 DP 80); 104.1>45.0(CE 26 DP 80)
濃動(dòng)度:0.3 mg/mL
進(jìn)樣量:2 µL
圖2 線性分析結(jié)果
樣品分析結(jié)果
按照國(guó)標(biāo)中19.1樣品前處理方法,對(duì)液態(tài)牛奶樣品進(jìn)行了前處理,進(jìn)樣分析,得到結(jié)果如圖3所示,牛奶樣品中含有膽堿量為1.08 mg/100g。
圖3 牛奶樣品分析結(jié)果
【色譜條件】
色譜柱:CC PC S2.7; 2.1 ×100mm
流動(dòng)相:A:10 mmol/L甲酸銨,甲酸調(diào)節(jié)pH為5.0
流動(dòng)相:B:乙腈
流動(dòng)相:B% 80%(0min) - 80%(1min) - 60%(3min) - 60%(5min) - 80%(5.1min) - 80%(8min)
流動(dòng)速:0.3 mL/min
溫動(dòng)度:40 ℃
檢動(dòng)測(cè):LC-MS; ESI; 104.1>60.0(CE 22 DP 80); 104.1>45.0(CE 26 DP 80)
濃動(dòng)度:0.3 mg/mL
進(jìn)樣量:2 µL
樣品制備:稱取2.5 g試樣,用溫水溶解后, 轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,冷卻至室溫,用水定容混勻。吸取1 mL樣液于50 mL比色管中,加入1 mol/L的鹽酸溶液10 mL,搖晃均勻,超聲振蕩5 min。樣液在70 ℃水浴中加熱3 h,冷卻至室溫后用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至5.0, 轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶,用水定容,混勻。然后用流動(dòng)相A稀釋10倍后,經(jīng)0.22 µm水性濾膜過濾至進(jìn)樣瓶中,待測(cè)。
分析注意事項(xiàng)
(1)在進(jìn)樣過程中發(fā)現(xiàn),由于該分析方法初始比例為高比例乙腈,高比例乙腈有可能導(dǎo)致樣品中剩余的少量蛋白在流動(dòng)相條件中析出,堵塞色譜柱造成柱壓升高??煽紤]在樣品配置后,使用初始比例流動(dòng)相對(duì)樣品進(jìn)行最終稀釋進(jìn)樣。
(2)HILIC系色譜柱日常使用維護(hù)與反相色譜柱有較大差別,需注意HILIC色譜柱的沖洗和保存。
結(jié)論
綜上所述,使用CAPCELL CORE PC S2.7; 2.1 mm i.d.×100 mm色譜柱,按照《GB 5413.20-2022 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測(cè)定》中第三法液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法,能夠獲得良好檢測(cè)結(jié)果,滿足標(biāo)準(zhǔn)要求。
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